Более безопасное редактирование генов CRISPR с меньшим количеством попаданий вне цели
Система CRISPR является мощным инструментом для целенаправленного редактирования геномов, обладающим значительным терапевтическим потенциалом, но рискует ненадлежащим образом редактировать «нецелевые» сайты. Однако новое исследование, опубликованное 9 июля 2020 года в журнале открытого доступа PLOS Biology Фэн Гу из Медицинского университета Вэньчжоу, Китай, и его коллег, показывает, что мутирование фермента в основе системы редактирования генов CRISPR может улучшить ее точность. Результаты могут обеспечить терапевтически более безопасную стратегию для редактирования генов, чем использование немодифицированной ферментной системы, по информации портала nexusrus.com.
Система CRISPR использует фермент Cas9 для расщепления ДНК. Cas9 разрезает практически любую последовательность ДНК. Его специфичность проистекает из его взаимодействия с «направляющей РНК» (gRNA), чья последовательность позволяет ему связываться с целевой ДНК посредством сопоставления пар оснований. Как только это происходит, фермент активируется и ДНК разрезается.
Система CRISPR встречается у нескольких видов бактерий; среди тех, которые обычно используются в исследованиях, у Staphylococcus aureus есть преимущество в размере - в отличие от некоторых других, его ген достаточно мал, чтобы поместиться в универсальный и безвредный вектор генной терапии, называемый аденоассоциированным вирусом, что делает его привлекательным для терапевтических целей.
Основным ограничением любой из систем CRISPR, в том числе от S. aureus, является расщепление ДНК вне мишени. Направляющая РНК может слабо связываться с сайтом, чья последовательность близка, но несовершенно совпадает; в зависимости от того, насколько близко совпадение и насколько тесно фермент взаимодействует с парным комплексом гРНК-ДНК, фермент может активироваться и неправильно разрезать ДНК с потенциально вредными последствиями.
Чтобы исследовать, можно ли модифицировать S. aureus Cas9 для расщепления с более высокой точностью до предполагаемой цели, авторы создали ряд новых мутантов Cas9 и проверили их способность распознавать несовершенные спички, сохраняя высокую активность на предполагаемом участке. Они обнаружили один такой мутант, который различал и отклонял отдельные несоответствия пар оснований между рРНК и ДНК, независимо от цели, увеличивая точность воспроизведения в 93 раза по сравнению с исходным ферментом. Они показали, что мутация затрагивала часть домена узнавания, области фермента, которая координирует контакты между ферментом и комплексом рРНК-ДНК. Мутация имела вероятный эффект ослабления этих контактов, таким образом гарантируя, что только самое сильное спаривание - которое получилось бы из идеального совпадения последовательностей - могло бы вызвать активность фермента.
«Избежание нецелевого расщепления является важнейшей задачей для разработки CRISPR для медицинских вмешательств, таких как коррекция генетических заболеваний или нацеливание на раковые клетки», - сказал Гу. «Наши результаты указывают путь к разработке потенциально более безопасных стратегий генной терапии».
Предыдущая статья Следущая статья
Вернуться
